乙型肝炎病毒标志物定量检测临床应用价值分析

郑州大学河南省医药科学研究院肝病研究室 杨小昂

球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)，而检测乙肝感染和机体免疫状态的常见指标为乙肝表面抗原（HBsAg）、表面抗体（抗-HBs）、e抗原（HBeAg）、e抗体（抗-HBe）和核心抗体（抗-HBc），即通常所说的“两对半”,随着研究的深入和新的抗病毒药物的问世，仅仅定性检测已经满足不了临床需求，临床上渴求一种灵敏度高而又可以进行定量检测的新型诊断试剂盒。目前随着定量免疫检测技术平台的完善和新的检测技术化学发光技术的发展和成熟，其研究和产业化生产对于乙型肝炎的防治并最终消灭乙型肝炎，具有重要意义，以下主要从产品的灵敏度的提高和各产品的临床意义做临床应用价值分析：

一、乙型肝炎病毒标志物定量检测产品采用国际先进化学发光检测技术及配对优良的包被和酶标记抗体，大大提高了检测灵敏度

以乙型肝炎病毒表面抗原为例，常规酶标（ELISA）检测HBsAg灵敏度是0.5～1.0ng/ml，而化学发光乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒的灵敏度为0.05-0.1ng/ml，对低表达的表面抗原和病毒发生变异也有较好的检出，高灵敏度的检测试剂可有效缩短急性乙型肝炎的窗口期，对于输血前和术前检测具有重要的意义。因此国际体外诊断试剂企业“巨头”如雅培（Abbott）和罗氏（Roche）等投入大量的人力、物力和财力来提高表面抗原检测试剂的灵敏度。

二、乙型肝炎病毒标志物单项定量检测和联合定量检测临床意义

1）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）定量检测的意义

A.新的化学发光检测技术的应用提高了检测的灵敏度和线性范围，使定量检测成为现实

B.可作为HBV携带者乙肝病毒复制的参考指标

血清HBsAg水平与肝内HBVcccDNA (乙肝病毒共价闭合环状DNA,是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始合成模板)水平相关，因此HBsAg水平可以作为衡量感染肝细胞数量的标志。

更重要的是，乙肝治疗降低HBsAg水平意味着可以降低肝内的cccDNA水平。cccDNA在目前技术条件下很难定量检测。而HBsAg定量检测相对容易（Chan et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2007）。

C.评价拉米夫定等核苷类药物的治疗效果

当乙肝病毒出现YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸） 突变出现的时候, 通常在生化指标出现异常之前血清HBsAg 浓度和HBV DNA滴度增加。在YMDD突变出现之后，血清 HBV DNA 持续升高, 然而HBsAg的增加是瞬时的, 与ALT的升高相似。在大部分病人中, 血清HBsAg的增加是由于HBV DNA的增加. 然而在某些病人中, 血清HBsAg在HBV DNA增加几个月之前便增加。除了监测HBV DNA 水平之外，同时监测血清HBsAg浓度或许能够有利于较早地发现在拉美呋定治疗中的耐药突变（Kohmoto et al. Journal of Medical Virology 75:235–239 (2005) 。

D．监测应用alpha-干扰素治疗病人的乙肝病毒复制

量化评估乙肝病毒表面抗原的出现是大有应用前景的，因为该方法是一简单而廉价的方法，可以用于慢性乙型肝炎患者接受干扰素治疗时监测病毒复制的指标。(Antiviral Res. 1994 Apr;23(3-4):251-7)

E.对alpha-干扰素治疗慢性乙肝病人的预后进行预测。

一项研究针对386例患者进行了HBsAg定量检测，其中127例采用PEG IFN a-2a单药治疗，137例采用PEG IFN a-2a联合拉米夫定治疗，122例采用拉米夫定单药治疗。研究发现，在第48周HBsAg水平<10 IU与治疗后3年HBsAg清除显著相关。在23例第48周HBsAg<10 IU/mL的患者中，12例(52%)在第3年获得HBsAg清除，而在HBsAg>10 IU/mL的患者中仅有4例(2.3%)获得HBsAg清除。

同时发现，治疗第48周时HBsAg自基线下降>100 IU/mL与治疗后3年HBsAg清除显著相关。26例治疗期间HBsAg下降>100 IU/mL的患者中，11例(42%)在第3年获得HBsAg清除，而下降<100IU/mL的患者中仅有3%获得HBsAg清除。所以， HBsAg定量监测对于预测PEG IFN a-2a治疗应答具有非常重要的意义（Brunetto M, et al. EASL 2008）。

 F． 确定肝移植病人免疫球蛋白的使用剂量

乙肝病人肝移植后使用乙肝免疫球蛋白（HBIG）可以有效地防止再感染的发生；在移植期间， HBIG 的应用剂量取决于HBsAg的水平而不是HBV DNA 水平。(J. Rosenau et al. / Journal of Hepatology 46 (2007) 635–644)

2）乙型肝炎病毒表面抗体（Anti-HBs）定量检测的意义：

表面抗体(Anti-HBs)是一种保护性抗体，是乙肝感染后痊愈或趋向治愈的象征；全程（3针）疫苗接种结束后1个月检测保护性表面抗体(Anti-HBs)的浓度，能够判定免疫效果。关于表面抗体与保护力的关系，世界标准未完全统一，目前普遍认为普通人群表面抗体浓度值≥10mIU/ml，就有足够的保护作用；高危人群表面抗体浓度值≥100mIU/ml，具有足够的保护作用。肝移植、血液透析及免疫抑制等病人定期检测表面抗体浓度值，每次检测值≥100mIU/ml为宜。（附表1为其它国家乙肝疫苗注射后监测效果及加强免疫和暴露后管理标准）

感染乙肝后，HBeAg及抗-HBe的出现与病毒在体内的复制有一定的关系，HBeAg为乙肝病毒C基因合成的可溶蛋白，是乙肝患者传染性强弱的标志之一，HBeAg阳性表明体内有大量 HBV-DNA复制。它也是乙肝由急性发展为慢性的指标；在乙肝急性期HBeAg在发病3个月后持续高浓度，则可能是急性乙肝发展为慢性的最早依据 ，患者肝组织伴有严重损害，易演变为慢性肝炎和肝硬化。慢性肝炎中 HBeAg持续高浓度提示HBV持续感染，而且发展肝硬化的概率比较高，孕妇血清高浓度HBeAg可能增加母婴垂直传播的机会，所以应该引起注意。

抗-HBe主要存在于HBsAg阳性携带者及迁延稳定或恢复期乙型肝炎患者的血清中，一般认为抗-HBe也是乙肝病情稳定的标志。另有研究表明高浓度抗-HBe率检出依次为肝癌 >肝硬化 >慢性乙肝 ，提示多数抗-HBe检出患者HBV感染时间较长，且抗-HBe主要见于低浓度 HBsAg的急、慢性乙肝患者或抗-HBs阳性的恢复期患者。

定量检测 HBeAg是有效监测乙肝复制及耐药和评估抗病毒药物疗效的指标，抗-HBe对预后判断起了很大的作用。具体分述如下：

A.抗病毒治疗起点的选择:

《美国肝病学会指南》指出， HBeAg阳性患者如果ALT>2ULN（upper limit of normal，正常值范围），应观察3-6个月，若HBeAg不能自然转阴，则应给予抗病毒治疗。中国《慢性乙肝防治指南》指出：IFN治疗的监测和随访治疗前应检查 ：病毒学标志，包括 HBsAg、HBeAg、抗一HBe和 HBV DNA的基线状态或水平；

B.抗病毒治疗终点的选择：

《慢性乙肝防治指南》认为，抗病毒治疗的三大治疗终点之一就是：HBeAg/抗HBe血清学转化。

《干扰素治疗慢性乙型肝炎专家建议》认为，HBeAg或HBeAb血清转换是患者接受治疗后发生免疫应答的结果，是目前公认的治疗终点，是较高的抗病毒治疗目标。

C.疗程的确认和个体化治疗方案调整：

   《干扰素治疗慢性乙型肝炎专家建议》，建议5提出如果患者的HBV DNA，尤其是HBeAg的定量呈现逐步和进行性下降时，判断可能出现HBeAg血清转换有重要意义。已经有一定程度的下降，建议继续观察治疗3个月，再根据患者应答情况决定是否调整治疗方案。

D.治疗过程中的监测和预测 ：

研究发现在治疗24周时，血清HBeAg水平低于10 PEIU/ml

的患者中，在72周时HBeAg血清转换率为52%；而中等HBeAg水平（HBeAg在10-100 PEIU/ml）的患者在72周时HBeAg血清转换率为20%；高HBeAg水平（HBeAg大于100 PEIU/ml）的患者在72周时HBeAg血清转换率仅为4%，其阴性预测值为96%。HBeAg定量的预测价值优于HBVDNA定量的预测价值（Fried et al. Hepatology，2008）。

《干扰素治疗慢性乙型肝炎专家建议》建议6提出关于干扰素治疗中的监测、随访和处理，在预测或判断是否出现持续应答时，根据HBV DNA和HBeAg定量和定性检测的动态变化进行综合判断。建议8提出“对于治疗过程中HBeAg和HBsAg滴度明显下降的患者应鼓励继续治疗，以取得更好的疗效”。

4）定量检测核心抗体(抗-HBc)的意义

核心抗体是最敏感的乙肝感染指标，有研究表明抗-HBc浓度波动与病情呈平行关系，与病毒增殖和肝细胞损害有关，在临床上常用高浓度或低浓度来判断乙肝的转归和预后，如果检出高浓度抗-HBc提示患病中。抗-HBc是 HBV感染后血清中最早出现的标志抗体，是流行病学调查的良好指标，其效价高，持续时间长，甚至终生携带。

A.可能与病毒血症相关

Yoshihiro 等发现急性自限性乙肝病毒感染的恢复者中，在感染初期低的抗-HBc滴度和较低抗-HBc滴度下降率与长期病毒血症显著相关。同时指出有必要继续对抗-HBc滴度与病毒血症间的关系以及它对急性乙肝发病的影响做进一步深入研究。

B.有利于隐匿性肝炎的发现

隐匿性乙型肝炎是由于s基因变异或者病毒基因表达低下造成的，常规检测试剂无法检出HBsAg。这些患者体内HBV持续存在，可引起输血后肝炎或组织移植感染。有研究发现单项抗-HBc阳性且滴度较高者HBV DNA阳性的比例为6.9%，故对于单项高滴度抗-HBc阳性应考虑进一步进行HBV DNA检查，以及早发现隐匿性HBV感染。

C.反映病毒感染的状态

乙肝急性感染常呈现高浓度的HBcAb，恢复期浓度降低,有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断,非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈进行性变化。

D.在输血检查中具有重要意义

核心抗体浓度的高低与HBV-DNA阴阳性结果有很大的相关性，核心抗体浓度越高，HBV-DNA阳性的比例越大。所以在有条件开展HBV-DNA的医院，还应该进一步检测HBV DNA，有利于输血安全。

5）乙型肝炎病毒标志物定量检测产品联合检测对急性乙肝和慢性无症状携带者转归分析

A.急性乙肝3-6个月痊愈转化分析，详见图1

B.急性乙肝3-6个月后转为慢性化后治疗起点的选择，详见图2

（图2，急性乙肝移行为慢性乙肝标志物浓度结合转氨酶综合分析图，建议根据标志物的浓度合理选择抗病毒治, 疗的时机，并动态观察，定时监测，参照<<乙型肝炎基础与临床>> 第三版 骆抗先主编  画图）

C.急性乙肝3-6个月后成为慢性无症状携带者结果分析，详见图3

（图3，急性乙肝移行为慢性无症状携带者标志物浓度结合转氨酶动态观察综合分析图，建议动态观察，定时监测，参照<<乙型肝炎基础与临床>> 第三版 骆抗先主编  画图）

D.慢性无症状携带者动态检测结果分析，详见图4

（图4，慢性无症状感染者HBV血清标志物的动态变化，HBeAg(+)期病毒标志物增长和稳定，抗-HBe出现；病变激活期病毒标志物部分清除，抗-HBe血清转换：抗-HBe（+）期血清HBV DNA渐趋阴转，HBsAg水平降低，参照<<乙型肝炎基础与临床>> 第三版 骆抗先主编  画图）

6）结合PCR诊断病情

血清HBV-DNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。由于PCR检测HBV DNA灵敏度的限制，HBV-DNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态，正确判断预后和治疗。在治疗过程中，如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或抗-HBe及抗-HBc浓度均还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密切关注。如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或抗-HBe及抗-HBc浓度均很低并逐步转阴，且持续一段时间，提示可能完全痊愈，预示疗效良好。

从上述资料可知，国外开展乙肝病毒标志物定量研究的比较多，而国内开展这方面研究的偏少，对于中国这个“乙肝大国”来讲，有大量的乙肝病人资源和可供研究的群体，期望卫生部相关专家、临床医生、检验科工作人员和试剂生产企业联其手来，加快开展乙肝五项定量标准的制定和临床应用价值的研究，共同致力于乙肝五项定量检测的标准化及乙肝的预防和诊治，减少乙肝的发病率。我们深信，随着乙型肝炎病毒标志物定量检测技术的成熟和国内外临床专家的认可，必将有更大的临床应用价值。